بررسی اثر القاء عصبی در تمایز سلول های استرومایی مغز استخوان به نورون شبه کولینرژیک در محیط کشت و مقیسه پیوند این سلول هانسبت به سلول های تمایز نیافته در ضایعه نخاعی contusive .

چکیده هدف:نورون های کولینرژیک از نورون های بسیار مهم نخاع می باشند که آسیب به آنها در ضایعات نخاعی منجر به نواقص حرکتی می گردد. در مطالعه حاضر سلولهای استرومایی مغز استخوان(bmsc)برای اولین بار به سلولهای شبه کولینرژیک تمایز داده شد و به ضایعات نخاعی مدل contusion در رت های ماده بالغ پیوند گردید.سپس بهبودی رفتاری به کمک تست رفتاری bbb ارزیابی شد. مواد و روش ها: این مطالعه در دو بخش in vitro و in vivo انجام گردید. ابتدا در مرحله in vitro سلول های استرومایی مغز استخوان از استخوان های بلند رت های بالغ جدا و در محیط کشت تا پنج مرحله پاساژ داده شد. ارزیابی درصد خلوص سلول ها و تست فابلیت زندگی و همچنین عدم تمایز خودبخودی به سلول های عصبی به روش ایمونوسیتوشیمی وrt pcr بررسی گردید. پس از اطمینان از عدم وجود تمایز جودبخودی ، مرحله پیش القاء به مدت 1 روز توسط ماده bme و مرحله القا به مدت 6 روز ngf بر روی این سلول ها انجام گرفت. کل مرحله تمایز در محیط کشت 7 روز بود و بررسی های لازم بر اساس 5 دسته کلی از ژن ها و مارکر های عصبی و در روزهای 0 ، 1 ، 3 ، 5 ، و 7 آزمایش انجام گردید. دسته اول شامل مارکر استرومایی فیبرونکتین و مارکر بنیادی oct-4 بود که به ترتیب به روش ایمونوسیتوشیمی و rt pcr بررسی شد. دسته دوم شامل مارکر های نوروبلاستی nf 68 و neurod بود که این دو مارکر نیز به ترتیب به روش ایمونوسیتوشیمی و rt pcr بررسی شد. دسته سوم، مارکرهای نورونی که شامل nf 200 ، neun وnf 160 بودند. دسته چهارم شامل مارکر های سیناپسی map2 و synapsin i و دسته پنجم مارکر کولینرژیکی chat بود که هر 3 دسته آخر به روش ایمونوسیتوشیمی بررسی شدند. نحوه انتخاب سلول برای پیوند پس از آنالیز آماری و بر اساس خصوصیات نوروبلاستی از یک طرف و وجود بیشترین سلول دارای آنزیم chat از طرف دیگر بود. بر اساس آنالیز آماری سلول های موجود در روز 3 برای پیوند انتخاب شدند. در طراحی مرحلهin vivo ، تعداد 45 سر رت ماده بالغ به 5 گروه تقسیم گردید. گروه اول یا sham فقط تحت عمل جراحی لامینکتومی در سطح مهرهl1 قرار گرفت، در حالی که در بقیه گروهها پس از لامینکتومی با رها کردن میله 10 گرمی از ارتفاع 5/2 سانتیمتری بر روی نخاع، ضایعه نخاعی به روش contusion ایجاد شد. در گروه دوم یا شاهد 1 (c1) پس از contusion هیچ درمانی صورت نگرفت. در بقیه گروهها، 7 روز پس از ضایعه تزریق صورت گرفت، به این ترتیب که در گروه سوم یا شاهد 2 (c2) µl9 نرمال سالین به شکل داخل نخاعی در محل ضایعه تزریق شد و در 2 گروه دیگر پیوند سلولی انجام گرفت. این دو گروه که شامل گروه آزمون 1 (e1) و گروه آزمون 2 (e2) بودند که به گروه e1 سلول استرومایی مغز استخوان به صورت تمایز نیافته و به گروه e2 سلول شبه کولینرژیک (سلول های نشان دار شده در روز 3) پیوند گردید. تست رفتاری bbb که شامل 2 مرحله پیش تست و تست اصلی است در روز قبل از ضایعه و روزهای0 ، 1 ، 4 ، 7 ، 8 و 14 و پس از آن هر هفته یک بار به طور منظم تا پایان هفته 12 انجام شد. بررسی بافت شناسی در پایان هفته 12 بر روی سگمانهای نخاعی t12-l1با استفاده از روش های هیستومورفولوژی و ایمونوهیستوشیمی برای تعیین میزان تغییرات بافتی و نحوه جایگزینی سلولهای پیوندی در 3 منطقه سری، مرکزی و دمی محل ضایعه بررسی گردید. یافته ها: مطالعات ایمونوسیتوشیمی، تست قابلیت زندگی وrt pcr با استفاده از مارکرهای fibronectin و oct-4 خلوص95 درصدی و زنده بودن 96 درصدی به همراه بنیادی بودن سلول ها را در مرحله پاساژ 5 نشان دادند. میزان سلول شبه کولینرژیک تولید شده پس از 7 روز 82% بود. بررسی 5 دسته از مارکر های گفته شده به روش ایمونوسیتوشیمی وrt pcr در طی روز های 1 ، 3 ، 5 و 7 نشان داد که در روز سوم از یک طرف بیشترین درصد سلول های مثبت به مارکر های nf 68 و chat وجود داشته و از طرف دیگر کمترین درصد سلول های مثبت به مارکر های نورون بالغ و سیناپسی را نسبت به روزهای دیگر داراست. تست رفتاری bbb موید بهبودی حرکتی تدریجی و خود بخودی در گروههای شاهد بود. هر دو گروه آزمون 1 و 2 بهبودی حرکتی معنی داری را نسبت به گروههای کنترل نشان دادند. میزان بهبودی حرکتی در گروه آزمون 2 در روز 11 و پایان هفته های 2و3و4 به طور معنی داری بالاتر از گروه آزمون 1 بود. سپس از هفته چهارم تا پایان هفته 12 اختلاف معنی داری در بین این دو گروه دیده نشد. یافته های اندازه گیری سطح مقطع نخاع و اندازه حفرات نشان دهنده کاهش معنی دار حفره و افزایش معنی دار سطح مقطع نخاع در هر 3 ناحیه سری، مرکزی و دمی پیوند در گروههای آزمون 1 و2 نسبت به گروههای شاهد بود. ولی در بین دو گروه آزمون از این نظر اختلاف معنی داری مشاهده نشد. بررسی های ایمونوسیتوشیمی با استفاده از ردیاب brdu نشان داد که بیشتر سلول ها در هر 2 گروه پیوندی در مناطق سری جایگزین شده اند و تعداد سلول ردیابی شده در گروه آزمون 2 به طور معنی داری کمتر از گروه ازمون 1 بود. نتیجه گیری: در طی مرحله القا مشخص گردید که استفاده از ngf به دنبال bme قابلیت تمایز سلول های استرومایی مغز استخوان را به نورون شبه کولینرژیک ایجاد میکند. پیوند این سلول ها به ضایعه نخاعی باعث بهبودی بیشتری در ماه اول نسبت به گروه تمایز نیافته و در تمام 3 ماه نسبت به گروه های کنترل گردید. جایگزینی کمتر این سلول ها در محل ضایعه نسبت به گروه تمایز نیافته شاید به دلیل وابستگی این سلول ها به ngf در طول مدت القاء بوده است. بر اساس اطلاعات ما تا به امروز این اولین مطالعه ای است که سلول های استرومایی مغز استخوان را به سلول های شبه کولینرژیک متمایز می کند. نتایج حاصل از این تحقیق این امید را فراهم می سازد تا از سلول های شبه کولینرزیک در درمان ضایعات نخاعی استفاده گردد. کلمات کلیدی: سلولهای استرومایی مغز استخوان، تمایز، سلولهای شبه کولینرژیک، پیوند، ضایعه طناب نخاعی